A história de Santos inicia-se com os relatos a respeito da Ilha de São Vicente apenas dois anos após o descobrimento oficial do Brasil, com a expedição de Américo Vespúciopara o reconhecimento da costa brasileira. Ao passar pela ilha dantes conhecida pelos indígenas sob o nome de Goiaó (ou Guaiaó), a expedição decidiu dar-lhe o nome do santo do dia, São Vicente.

A coroa portuguesa interessou-se pouco pela região nos trinta anos que se seguiram à expedição. Durante este tempo, vários corsários e piratas acudiam à região em busca dopau-brasil, madeira nobre que era objeto de cobiça na época, largamente explorada pelos portugueses na Mata Atlântica.

No entanto, em 1531, devido à decadência dos negócios da coroa portuguesa na Índia, o Brasil volta ao centro das atenções. Uma esquadra de demarcação e posse de territórios é enviada pelo monarca D. João III à Ilha de São Vicente. O chefe da esquadra, o navegador Martim Afonso de Sousa, encontra na entrada do atual estuário de Santos (Ponta da Praia) um pequeno povoado e um atracadouro, conhecido como Porto de São Vicente. Um dos degredados trazidos pela expedição de Américo Vespúcio,Cosme Fernandes, fundara aí essa colônia, e prosperava graças ao comércio com os indígenas. A vila de São Vicente também refletia a prosperidade das atividades econômicas de Fernandes.

Martim Afonso, no entanto, expulsa Cosme Fernandes das terras e ocupa o porto de São Vicente. Também distribui sesmarias na parte norte da ilha, conhecida como Enguaguaçu, onde se encontravam terras adequadas ao plantio. Aí se estabelecem colonizadores portugueses, tais como Luís de Góis (e sua esposa Catarina de Andrade), Domingos Pires, Pascoal Fernandes, Francisco Pinto, Rui Pinto e os irmãos José e Francisco Adorno, que construíram um engenho perto do atual Morro de São Bento. A vida do novo povoado, entre 1530 e 1543, passou a girar em torno do engenho e do plantio. Com a invasão e saqueio da vila de São Vicente por Cosme Fernandes, que se vingou por haver sido expulso em 1531 por Martim Afonso de Sousa, e com o maremoto posterior que danificou seriamente essa vila, a população do povoado do Enguaguaçu só fez crescer.